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L’HBV DNA intraepatico, correlazioni cliniche e terapeutiche

Gian Paolo Caviglia Dipartimento di Scienze Mediche, Università degli Studi di Torino

L’infezione cronica da virus dell’epatite B (HBV) resta tuttora un problema di sanità pubblica a livello mondiale con più di 300 milioni di portatori cronici di infezione;

di questi, l’Organizzazione Mondiale della Sanità stima che meno del 10% sia consapevole del proprio stato di portatore.

Nonostante la disponibilità di un vaccino per la prevenzione dell’infezione da HBV e antivirali sicuri ed efficaci per la soppressione della replicazione virale, l’infezione

cronica da HBV è tuttora responsabile di più di 500.000 morti all’anno per cause epatologiche (1). Biologia di HBV

Il virus dell’epatite B (HBV) è un virus a DNA il cui genoma di 3.2 Kilobasi (Kb) è racchiuso in un involucro lipoproteico. L’ingresso e l’infezione dell’epatocita da

parte di un virione di HBV avviene tramite legame con il polipeptide di co-trasporto di sodio taurocolato (NTCP), con successivo rilascio del nucleocapside

virale nel citoplasma (Figura 1) (2). Attraverso i pori nucleari, il DNA circolare

rilassato di HBV (relaxed circular DNA, rcDNA) viene trasferito nelnucleo dell’epatocita e convertito inDNA circolare covalentemente chiuso(covalently closed circular DNA, cccDNA).Il cccDNA è responsabile della persistenzaa tempo indefinito di HBVnell’epatocita infetto e funge da stampoper la trascrizione delle molecole

di HBV RNA: 1) HBV RNA subgenomico; 2) pre-core RNA; 3) HBV RNA pre-genomico (pgRNA). Le molecole di RNA subgenomico fungono da trascritti per la sintesi delle

proteine di superficie di HBV (hepatitis B surface antigen, HBsAg) e della proteina

regolatoria HBx. Dal pre-core RNA origina la proteina secretoria e (hepatitis B e antigen, HBeAg), mentre dal pgRNA originano le proteine core del nucleocapside, la polimerasi virale. Inoltre, il pgRNA funge da stampo per la trascrizione inversa in rcDNA. Il nucleocapside può quindi essere rivestito con le proteine di superficie e rilasciato dall’epatocita infetto, oppure indirizzato al nucleo cellulare per rifornire le scorte di cccDNA (3).

Parallelamente, tramite un meccanismo non coinvolto nella produzione di nuovi virioni maturi, l’HBV DNA può integrarsi nel genoma dell’ospite.

L’origine e la determinazione dell’HBV DNA intraepatico rivestono importanti

implicazioni cliniche e terapeutiche

Questo fenomeno presuppone la sintesi aberrante di molecola di HBV DNA

lineari a doppia catena (double-strand linear DNA, dslDNA) durante la retrotrascrizionedi pgRNA. In manieraanaloga, nucleocapsidi virali contenenti

dslDNA possono essere destinati alla sintesi di nuova progenie di HBV oppure

riciclati nel nucleo della cellula.

In quest’ultimo caso, il dslDNA può essere incorporato nel DNA cellulare a livello

di specifiche fratture genomiche, e a sua volta determinare la trascrizione di

RNA virali subgenomici contribuendo alla sintesi di HBsAg e HBx (4).

Persistenza del cccDNA: implicazioni cliniche

Il cccDNA riveste un ruolo chiave nella replicazione diHBV e nel determinare la persistenza virale.

I farmaci attualmente approvati per la cura dell’epatite cronica B consentono la soppressione della replicazione virale con normalizzazione della transaminasi (risposta virologica), e in casi limitati la perdita dell’HBsAg con o senza sieroconversione ad anti-HBs (cura funzionale).

Tuttavia, i farmaci attualmente disponibili sono inefficaci nei confronti di cccDNA; la ricerca scientifica e farmacologica è da tempo impegnata nello sviluppo di nuovi farmaci in grado di ridurre, silenziare o eradicare il cccDNA (5).

Per questo motivo, risulta fondamentale poter disporre di tecnologie e metodiche sufficientemente sensibili e specifiche in grado di identificare e quantificare correttamente il cccDNA intraepatico.

Quantificazioni del cccDNA intraepatico

Diverse tecniche sono state sviluppate e proposte per la quantificazione diretta del cccDNA intraepatico, ciascuna di esse con i propri vantaggi e limiti (Tabella 1) (6).

Si tratta di metodiche sofisticate in biologia molecolare basate su un approccio invasivo (necessità di biopsia epatica), seguito da un indaginoso lavoro laboratoristico che consiste nell’estrazione del DNA tessutale, selettiva digestione

enzimatica per la rimozione degli intermedi replicativi diversi dal cccDNA, e successiva amplificazione del cccDNA utilizzando primer oligonucleotidici specifici che fiancheggiano la regione del gap di HBV DNA (7). Date le caratteristiche peculiari di queste metodiche, l’appropriatezza da definirsi in funzione della specifica applicazione (ad esempio: quantificazione di cccDNA in soggetti con infezione occulta da HBV vs. soggetti con infezione overt).

Ruolo di HBV DNA integrato nella storia naturale dell’infezione cronica da HBV e

implicazioni terapeutiche

L’HBV DNA integrato rappresenta una forma stabile di DNA virale che si osserva regolarmente nei soggetti coninfezione cronica da HBV. L’integrazione di HBV DNA

nel genoma dell’ospite è un evento che avviene precocemente già nelle prime fasi dell’infezione virale e persiste nel corso dell’infezione. Si ritiene che sia strettamente

associato alla risposta infiammatoria immuno-mediata responsabile di un danno ossidativo a carico del DNA dell’ospite, con conseguente produzione di fratture genomiche, sede di integrazione da parte di HBV (8). Un recente studio ha evidenziato che l’integrazione di HBV DNA può avvenire in diverse regioni dell’esoma

ed è presente in una considerevole quota di soggetti HBeAg-negativi con bassa viremia e limitato reservoir intraepatico di HBV (9). In particolare, l’integrazione a

carico di geni coinvolti nella regolazione dei processi di proliferazione cellulare, oncogeni e geni oncosoppressori, conferisce agli epatociti infetti un vantaggio in termini di sopravvivenza, ponendo le basi per l’espansione clonale

degli epatociti in cui alberga l’HBV DNA integrato, contribuendo

quindi allo sviluppo di carcinoma epatocellulare (hepatocellular carcinoma, HCC).

Inoltre, studi nel modello animale hanno dimostrato che la maggior parte dei trascritti virali, da cui originano anche le proteine di superficie di HBV, provengono da HBV DNA integrato (10). Ne consegue che nel corso dell’infezione

da HBV, la sintesi dell’HBsAg può derivare da due fonti distinte: sia dalla trascrizione da parte del cccDNA sia dalla trascrizione da parte del gene HBV-S integrato

nel genoma dell’ospite.

Sono stati utilizzati diversi metodi per rilevare l’integrazione di HBV nel genoma

della cellula ospite, anche realizzati grazieallo sviluppo e all’implementazione delle tecniche di Next Generation Sequencing

Questa caratteristica peculiare di HBV diventa estremamente rilevante nella possibilità di ottenere una cura funzionale, rendendo necessario lo sviluppo di nuovi farmaci in grado di bersagliare non solo i trascritti derivanti dal cccDNA ma anche quelli codificati dal genoma di HBV integrato. Infine recenti evidenze supportano la possibilità da parte del genoma di HBV di integrarsi nel DNA mitocondriale mediante un processo di importazione di sequenze di HBV RNA nell’organello cellulare (11); tale fenomeno potrebbe conferire plasticità metabolica ad epatociti pre-neoplastici

o cellule tumorali che verrebbero positivamente selezionate favorendo la genesi

tumorale.

Identificazione di HBV DNA integrato

Negli ultimi decenni sono stati utilizzati diversi metodi per rilevare l’integrazione

di HBV nel genoma della cellula ospite (Tabella 2) (12). L'ibridazione Southern blot mediante sonde specifiche per HBV DNA è stato il primo metodo utilizzato per studiare e caratterizzare il fenomeno dell’integrazione virale di HBV in campioni di HCC-HBV correlato e nel tessuto peri-lesionale. Successivamente, le tecniche in biologia molecolare (quali Alu PC e inverse nested PCR) hanno permesso di migliorare la sensibilità e l’accuratezza dell’indagine. Infine, lo sviluppo ed implementazione di tecniche di Next Generation Sequencing (NGS) ha permesso di sviluppare protocolli di sequenziamento dell’intero genoma (Whole

Genome Sequencing, WGS), esoma (Whole Exome Sequencing, WES), e trascrittoma (RNA Sequencing, RNA-seq) che permettono di sequenziare milioni di sequenze (reads) in parallelo con bassissimo tasso di errore; con il costo di NGS in continua diminuzione, in futuro l’unico fattore limitante per queste metodiche sarà la disponibilità di potenza di calcolo per analizzare grandi set di dati

Fonte: readfiles.it


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